Lopetegui, que tinha assumido o cargo em novembro do ano passado, deixou o clube devido a "divergências de opinião em alguns temas" com a diretoria, especialmente a política de contratações.
O'Neil, de 40 anos e considerado um dos melhores treinadores de sua geração, era cotado para suceder o espanhol desde que foi demitido do Bournemouth, apesar de ter livrado a equipe do rebaixamento de forma milagrosa na temporada passada.
"É um prazer receber Gary no clube", declarou o diretor esportivo do Wolverhampton Matt Hobbs em um comunicado.
"É um treinador jovem, muito motivado e elogiado por todos com quem já trabalhou. Estamos ansiosos para ver o que podemos conseguir juntos", acrescenta a nota.
O Wolverhampton estreia na Premier League na próxima segunda-feira (14), fora de casa, contra o Manchester United.