Após quase dois anos de investigação, a perícia técnica-criminal da PF confirmou que fogo começou no auditório Roquette Pinto, localizado no térreo, provavelmente causado por curto-circuito em um dos aparelhos de ar condicionado. O laudo pericial descartou a hipótese de incendiarismo ou ação criminosa.
Segundo a investigação, em agosto de 2015, o Corpo de Bombeiros havia iniciado uma fiscalização no prédio, que não foi concluída.
O oficial responsável pela inspeção foi punido administrativamente.
Com base nas provas colhidas, a PF também descartou omissão da ex-diretora do museu Cláudia Rodrigues e do reitor da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Roberto Leher.
Isso porque, antes do incêndio, os dois iniciaram tratativas com o Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social (BNDES) para revitalizar o prédio - alegando, entre outros motivos, adequação ao Código de Segurança contra Incêndio e Pânico. O contrato foi assinado em junho de 2018, mas o valor não foi desembolsado antes do sinistro.
O incêndio de grandes proporções começou na noite do domingo, dia 2 de setembro de 2018, e só foi controlado no fim da madrugada de segunda-feira. A maior parte do acervo, de cerca de 20 milhões de itens, foi totalmente destruída. Desde então, mais R$ 72 milhões foram liberados para reconstrução do prédio bicentenário.